Follow us:

PCR反应条件的优化


PCR反应条件的优化


⑴  变性温度和时间:
     保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。
    加热90~95℃,30~60s,再复杂的DNA分子也可变性为单链。可根据模板DNA复杂程度,调整变性温度和时间, 模板G+C含量高的,变性时间可适当延长。一般情况下选择94 ℃ 30 s,可使各种复杂的DNA分子完全变性。
    温度过高或高温持续时间过长,可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。

⑵ 复性温度和时间:
   PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。
   复性的温度主要由引物的Tm值决定(低于Tm值2~3℃),  一般位于50~60℃,30~60s。
   复性温度越高,产物特异性越高。复性温度越低,产物特异性越低。  一般情况下选择55℃ 30s,足以使引物与模板之间完全结合。
⑶ 延伸温度和时间:
    一般位于Taq酶的最适作用温度70~75℃之间。
   引物小于16个核苷酸时,过高的延伸温度不利于引物与模板的结合,可以缓慢升温到70~75℃。
   延伸反应时间,可根据待扩增片段的长度而定,<1kb,1min足够;>1kb需加长延伸时间,10kb片段延伸时间可达15min。
   延伸时间过长可出现非特异扩增,常用72 ℃ 1min
⑷ 循环数:
    其他参数选定后,PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。
   理论上说20~25次循环后,PCR产物的积累即可达到最大值,实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%,因此不管模板浓度是多少,25~35次是比较合理的循环次数。
   循环数不宜过多,过多会导致非特异扩增的增加。