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引物设计的原则


 


总原则:提高扩增效率和特异性
 
⑴ 长度18~30 bp,过短特异性降低,过长则成本增加,产量也下降。
⑵ 引物碱基尽可能随机分布,避免出现嘌呤、嘧啶堆积现象,引物 G+C 含量宜在45 ~ 55%左右。
⑶ 引物内部不能含有自身互补序列,否则会形成发夹样二级结构,两个引物之间尤其在 3’ 末端不应有互补链存在,不然会形成引物二聚体。
⑷ 引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性或多于连续8个的互补碱基。要求在引物设计时采用计算机进行辅助检索分析。
⑸ 引物的解链温度:两条引物之间的Tm值应尽可能接近,不应超过4℃ 。
⑹ 引物的 5′ 末端碱基:并没有严格的限制,只要与模板DNA结合的引物长度足够,其 5′ 末端碱基可以不与模板DNA匹配呈游离状态。因此常用来引进修饰位点或标记物
(7)引物的 3′ 末端碱基:引物3′末端碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大影响。不同末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他三个碱基,因此尽可能避免在引物3’ 端使用碱基A